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人肝臟類器官培養手冊

2023-3-31  閱讀(222)

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人肝臟類器官培養手冊

 

背景介紹

肝臟是人體中最大的器官之一,來源于內胚層中前腸上皮細胞發育而來的肝芽結構,以代謝功能為主,發揮“解毒"作用。肝功能失衡會導致稱為肝衰竭的病理狀況,并導致肝炎、纖維化、肝硬化、癌癥、代謝或自身免疫性疾病。因此,為充分了解每種肝病的表型和損傷器官的機制,我們需要體外個性化肝模型系統進行疾病建模、藥物發現和藥物毒性學習。

 

肝臟類器官(hepatic organoids, HLO, HO)是肝臟功能的3D模型,保留了肝細胞的主要生理特征。在存在或不存在基質的情況下,可以從iPSC、ESC或特定的成體細胞(例如上皮細胞或上皮細胞和間充質細胞)生成類器官。

 

 

肝臟類器官的培養方案

我們根據JCI Insight[1]、Cell Metab[2]和J Hepatol[3]發表的三篇文章,整理了由人類誘導多能干細胞(human iPSCs)生成肝臟類器官的培養方案。

 

圖1.iPSC分化為肝類器官的過程(PMID: 28878125)[1]

 

A:iPSC分化為肝類器官的示意圖;B-C:在第0天(iPSCs)、第3天(定形內胚層,EN)、第6天(前腸,FG)、第9天(成肝細胞,HB)、第20天(HO1)和第62天(HO2)在HO發育過程中發生的形態學和細胞標記變化。

 

 
 
 
誘導定型內胚層

iPSC在含有5 mM EDTA和10 mM Y-27632的緩沖液解離為單個細胞,接種到低吸附的6孔板上,然后用含有激活素A (100 ng/mL)和BMP4 (10 ng/mL)的RPMI-1640培養基培養3天;

 

 
 
 
誘導前腸球體

更換為含有2% Matrigel和B27的RPMI培養基;第3 -6天,培養基中加入50 ng/mL FGF10;第6-9天,培養基中加入10 ng/mL FGF10和10 ng/mL BMP4;

 

 
 
 
誘導類器官

第9天后,更換為含有1% Matrigel、50 ng/mL HGF、50 ng/mL oncostatin M和10 μM Dexamethasone的類器官生長和分化培養基(HCM)中。

 

 圖2.iPSC分化為肝類器官的過程(PMID: 31155493)[2]

A:iPSC分化為肝類器官的示意圖;B:在第0天(iPSCs)和第20天(HLO)明場圖像。

 

 
 
 
類器官擴增

在第20天收集培養物,將細胞解離,200 g離心3 min收集細胞,重懸于50 μL GFR-Matrigel中,接種到24孔板中。Matrigel凝固后,加入1 mL生長培養基(RPMI-1640, B27, 250 nM LDN-193189, 3 μM CHIR99021, 10 μM A83-01, 100 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF10和20 ng/mL HGF),培養細胞6天,更換為分化培養基(HCM medium, 10 μM DAPT, 10 ng/mL oncostatin M, 20 ng/mL HGF, 10 μM Dexamethasone, 10 ng/mL BMP4)再培養6天。

 

 

相關產品

 

產品名稱

產品編號

規格

簡介

Y-27632

53006ES

1 mg/5 mg/10 mg

ROCK抑制劑

CHIR99021

53003ES

2 mg/5 mg/10 mg

GSK-3α/β抑制劑

Dexamethasone 地塞米松

53269ES

250 mg/500 mg/1 g

糖皮質激素受體激動劑

LDN193189

53012ES

5 mg/10 mg

BMP信號通路抑制劑

A 83-01

53002ES

1 mg/5 mg/10 mg

TGF-β信號抑制劑

DAPT

52104ES

10 mg/50 mg

Notch通路抑制劑

human BMP4

92053ES

10 μg/100 μg/500 μg

重組蛋白

human EGF

92708ES

100 μg/500 μg

重組蛋白

human Activin A

91702ES

10 μg/100 μg/500 μg

重組蛋白

human FGF4 

91303ES

5 μg/100 μg/500 μg

重組蛋白

human FGF10

91306ES

5 μg/100 μg/500 μg

重組蛋白

human HGF

92055ES

10 μg/50 μg/1 mg

重組蛋白

human oncostatin M

92254ES

10 μg/100 μg/500 μg

重組蛋白

N-2 supplement,serum free,100X

60706ES

5 mL

用于細胞和組織體外培養

HEPES溶液(1 M),細胞培養級

60117ES

100 mL

化學緩沖劑

Sodium Pyruvate丙酮酸鈉

60370ES

10 g/100 g

抗氧化

BSA牛血清白蛋白,診斷級別

36102ES

25 g/100 g/500 g/1 kg

用于細胞培養

50× B-27無血清添加劑,去除維生素A

60704ES

10 mL

無血清添加劑

 

 

參考文獻

[1] Guan Y, et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight

. 2017 Sep 7;2(17):e94954.

[2] Ouchi R, et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metab. 2019 Aug 6;30(2):374-384.e6.

[3] Mun SJ, et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. J Hepatol. 2019 Nov;71(5):970-985.


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