干貨 | 甲基化和羥甲基化測序技術介紹
DNA甲基化是最早被發現、也是研究最深入的表觀遺傳調控機制之一。第一個被發現的5-甲基胞嘧啶(5mC)是研究最多的修飾堿基，它在從基因調控到正常發育的廣泛生物過程中發揮著重要作用，被認為是第五個堿基。5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)是由5mC經過TET家族酶氧化而來，在神經元細胞含量較高，被認為是第六堿基。
DNA甲基化修飾在維持正常細胞的功能、雌性個體X染色體失活、寄生DNA序列的抑制、基因組結構穩定、遺傳印記、胚胎發育、及腫瘤和疾病的發生、發展緊密相關，具有至關重要的作用。5mC可以導致基因沉默或基因表達水平降低，因此，腫瘤抑癌基因的過甲基化或原癌基因的低甲基化在多種腫瘤中被發現。而5hmC作為去甲基化過程的第一步，則會導致基因激活或基因表達水平增高，研究表明DNA的5hmC在多種腫瘤中有明顯降低。因此，分析基因組的5mC和5hmC水平具有重要的臨床意義。WGBS（Whole-genome bisulfite sequencing）被視為甲基化測序的“金標準"，主要檢測5mC和5hmC兩種修飾形式。在此基礎上衍生出了的一些方法用來區分5mC和5hmC，比如氧化亞硫酸氫鹽測序（oxBS-seq）被用于5mC特異性測序，以及TET輔助的重亞硫酸鹽測序(TAB-seq)特異性檢測5hmC。近年來，基于酶法轉化的甲基化測序技術不斷涌現出來，APOBEC偶聯甲基化表觀測序 (ACE-seq）可以特異性檢測5hmC，以及酶法甲基化測序(EM-seq)可同時檢測5mC和5hmC。TAPS技術一改之前將未發生甲基化修飾的C轉化未U的方法，創新性的實現了正向檢測甲基化位點的測序技術，其衍生技術TAPSβ及CAPS，亦可實現5mC和5hmC的區分，具有巨大的潛力。該技術在將傳統的BS-Seq技術與化學氧化相結合，先利用高釕酸鉀KRuO4將DNA上的5hmC氧化成5fC，再用重亞硫酸鹽處理，5fC和沒有任何修飾的C就被轉化成U，而5mC則不會被轉化，仍然保持為C。如此則可以特異性的檢測5mC，BS-Seq和oxBS-Seq聯合測序也可實現對5hmC單堿基分辨率的檢測。其技術原理示意圖如下（圖1）：圖1.oxBS-seq 5mC單堿基分辨率測序（Booth, M. J. et al.2012, Science）用糖基把羥甲基化的C給保護起來，然后用TET蛋白（Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1），把甲基化的C轉化成羥基化的C，進一步將羥甲基化的C轉化成甲酰化的C和羧基化的C。甲酰化的C和羧基化的C都可以被亞硫酸氫鹽轉化成U。而之前被糖基化保護起來的羥甲基化的C，是不會被TET蛋白轉化成甲酰化的C或者羧基化的C的。在亞硫酸氫鹽的處理過程中，它還保持是C。并且在之后的PCR擴增產物中，也表現為C。這樣，就可以把羥甲基化的C和甲基化的C給區分開來，從而特異性的檢測5hmC。其技術原理示意圖如圖（圖2）：圖2.TAB-seq 5hmC單堿基分辨率測序 (Yu, M. et al. 2012, Cell)不同于傳統的BS-Seq，該技術使用AID/APOBEC家族DNA脫氨酶APOBEC3A (A3A)代替化學脫氨，保證了DNA的完整性。首先，利用T4 β-葡糖基轉移酶（βGT）將5hmC轉化成5ghmC，5ghmC不會被A3A酶脫氨基，這樣A3A能夠特異地脫去C及5mC的氨基使其變為U，而5ghmC則因為不被該酶識別，測序時仍被檢測為C。這樣，可將5hmC與C及5mC區分開來，實現特異性檢測5hmC。該技術原理示意圖如下（圖3）：圖3.ACE-seq 5hmC單堿基分辨率測序(Schutsky, E. K. et al. 2018, Nat. Biotechnol)全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）長期以來一直是甲基化圖譜分析的金標準，但重亞硫酸鹽的化學反應會破壞和降解DNA，導致DNA斷裂和丟失。基于酶法的甲基化測序就克服了這個缺點。Enzymatic Methyl-seq（EM-seq）通過酶法完成WGBS建庫，其對DNA的酶處理分為兩步：第一步使用TET2酶以及氧化增強劑將5mC和5hmC氧化成5caC，保護經過修飾的胞嘧啶；第二步利用脫氨酶APOBEC對胞嘧啶進行脫氨處理，此步驟不會對5caC造成影響，從而實現5mC和5hmC的檢測。其技術原理示意圖如下（圖4）：
圖4.EM-seq 單堿基分辨率測序(Vaisvila, R. et al.2020, bioRxiv)TET輔助吡啶測序（TAPS）(TET-assisted pyridine borane sequencing)、TAPSβ及CAPS
在TAB-seq中講到TET蛋白可以把甲基化的C轉化成羥基化的C，進一步將羥甲基化的C轉化成甲酰化的C和羧基化的C。TAPS技術發現5caC可以被吡啶及衍生物（Pyridine borane）還原為二氫尿嘧啶（dihydrouracil，DHU），而DHU在鏈擴增方面與自然的U堿基并沒有差異，這樣經過PCR擴增DHU可以轉化為T，從而到達不用亞硫酸鹽處理將甲基化的C堿基轉為T堿基的目的。TAPS得到的DNA文庫復雜度高（僅把占比很小的甲基化C進行了改變，對DNA的天然序列改變很小，堿基平衡），避免了bisulfite法引起的DNA損傷及文庫的不平衡，對Illumina測序儀更加友好，數據質量較高。TAPS的衍生方法TAPSβ及CAPS可分別用于檢測5mC和5hmC。TAPSβ也是用糖基化酶把羥甲基化的C給保護起來，使其免受TET氧化。再使用TET酶將甲基化的C轉化羥甲基化的C在轉化成甲酰化的C和羧基化的C。5caC則可在吡啶還原為二氫尿嘧啶，而被保護起來的羥甲基化的C則不變。經過后續步驟測序則可特異性的區分5mC。CAPS技術仍利用利用了oxBS-seq中高釕酸鉀KRuO4將DNA上的5hmC氧化成5fC，經吡啶的衍生物（pic-borane）5fC還原成二氫尿嘧啶，從而實現特異性的檢測5hmC。該系列技術原理示意圖如下（圖5）：圖5.TAPS、TAPSβ、CAPS 單堿基分辨率測序(Liu, Y. et al.2021, Nat Commun)
以上就是幾種對于5mC和5hmC測序方法，隨著高通量測序技術的發展以及新技術的不斷涌現，甲基化檢測技術將在癌癥早期診斷及篩查領域有更廣闊的發展前景。產品名稱 | 產品編號 | 規格 |
Hieff NGS® Methyl-seq DNA library Prep kit for Illumina® | 12211ES08 | 8T |
12211ES24 | 24T |
12211ES96 | 96T |
Hieff Canace® 耐U+高保真DNA聚合酶 | 10145ES60 | 100 U |
10145ES76 | 500 U |
[1] Booth, M. J. et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science 336, 934–937 (2012).
[2] Yu, M. et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell 149, 1368–1380 (2012).
[3] Schutsky, E. K. et al. Nondestructive, base-resolution sequencing of 5-hydroxymethylcytosine using a DNA deaminase. Nat. Biotechnol. 36,1083–1090 (2018).
[4] Vaisvila, R. et al. EM-seq: detection of DNA methylation at single base resolution from picograms of DNA. Preprint at bioRxiv
[5] Liu, Y., Hu, Z., Cheng, J. et al. Subtraction-free and bisulfite-free specific sequencing of 5-methylcytosine and its oxidized derivatives atbase resolution. Nat Commun 27;12(1):618(2021).
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