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Yeasen Hieff Clone® 一步法克隆試劑盒榮登《Cell》《Science》等國際頂尖期刊
提起“分子克隆"或“載體構建"這兩個詞，大家可能最先想到的是傳統酶切酶連法，即用限制性內切酶產生黏性末端，通過T4 DNA連接酶連接兩個片段的克隆方法。該方法存在著一些明顯的局限，如連接反應時間長，操作繁瑣，克隆效率低，酶切位點的選擇易受到限制等。
為了提高克隆效率，節省反應時間，基于同源重組酶的無縫克隆技術應用而生。與傳統酶切酶連技術相比，無縫克隆技術操作簡單快速，不受到酶切位點的限制，可一次進行多個片段的拼接，大大的提高了克隆效率。
翌圣生物在成熟的工具酶表達純化平臺基礎上，獲得高純度重組酶，并反復優化重組酶反應微環境，研發出Hieff Clone®系列無縫克隆試劑盒。
Hieff Clone®克隆試劑盒可以將PCR產物定向克隆至任何載體的任何位點，可高效克隆50 bp-10 kb片段。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5'端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產物5'和3'末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的*一致的序列。PCR產物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃反應15-20 min即可進行轉化，完成定向克隆，克隆陽性率可達95%以上。
產品優勢
? 無需考慮酶切位點：不受插入片段酶切位點的限制，適用于任何載體；插入片段兼容粘性或平末端。
? 設計簡單：在插入片段的PCR擴增引物5'端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。
? 快速高效：50℃，20 min即可完成重組反應。克隆陽性率可達95%以上。
? 應用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆，高效克隆50 bp-10 kb片段；也可結合Canace高保真酶，應用于定點突變。
實驗操作流程
? 線性化載體的制備：酶切或PCR制備線性化載體
? 插入片段的制備：在目的DNA片段上下游引物的5'端引入15-25 bp左右載體末端同源序列；PCR反應擴增目的片段。
? 重組反應：按比例混合線性化載體和目的DNA片段進行重組，50℃反應15-20 min。
? 轉化、涂板：將重組產物直接轉化后涂平板，陽性克隆鑒定。
圖1：Hieff Clone®一步法快速定向克隆試劑盒進行單片段和多片段克隆實驗流程圖。
實驗數據
? 單片段高效重組
圖2：Hieff Clone® One Step Cloning Kit可以有效克隆不同長度的單片段基因。
A-D：重組轉化平板。E：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。F-H：插入片段PCR鑒定電泳圖。箭頭指示目的條帶。載體：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分別是1.2 kb，3 kb和5 kb，載體與插入片段摩爾比：1:3，重組反應條件：50℃，20 min。
? 多片段輕松重組
圖3：Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit進行三片段克隆。
A：重組轉化平板。B：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。C：PCR方法鑒定每個單片段和最終連接基因。箭頭指示目的條帶。載體：pCAMIBA1302，10 kb，三個插入片段長度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重組反應條件：50℃，20 min。
客戶反饋
? 長片段重組
實驗信息：載體大小：8000 bp，目的片段大小：7500 bp。
實驗數據：
圖5：使用Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit進行克隆。
A：陰性對照轉化平板。B：重組質粒轉化平板。C：載體和目的片段的濃度檢測電泳圖。D：菌落PCR鑒定電泳圖，箭頭指示目的條帶。 M1：Marker Ⅲ；M2：100 bp DNA ladder。(仁濟醫院)
? 多片段重組
實驗信息：載體大小：3996 bp；四個片段大小：576 bp，867 bp，915 bp和647 bp。
實驗數據：
圖6：使用Hieff Clone® Multi One Step Cloning Kit進行克隆。
A：重組質粒轉化平板。B：1為載體酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖。C：菌落PCR驗證結果，其中1為原始質粒對照電泳，2-5為重組質粒，僅檢測863bp的一個目的片段，6為假陽性。D：陽性克隆測序結果。M：Marker II。（微生物所)
部分發表文獻
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FAQ
Q：Hieff Clone®克隆的原理是什么？
A：利用末端同源重組的原理。將任意線性化載體和具有與其兩端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。
Q：與傳統克隆相比，Hieff Clone®克隆有什么優勢？
A： 1）無需考慮酶切位點：不受插入片段酶切位點的限制，適用于任何載體；插入片段兼容粘性或平末端。
2）設計簡單：在插入片段的PCR擴增引物5'端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。
3）快速高效：50℃，20 min即可完成重組反應。克隆陽性率可達95%以上。
4）應用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆，也可結合Canace高保真酶，應用于定點突變。
Q：同源序列長度對重組效率的影響？
A：同源序列的長度與克隆數目有相關性，一般同源片段選擇在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范圍內調整。并且選擇盡量避免出現二級結構。
Q：線性化載體和目的片段產物的質量會影響重組反應嗎？
A：線性化載體或目的片段品質較差時會極大影響重組反應，建議割膠回收純化產物。
Q：一步法快速定向克隆試劑盒對感受態細胞有要求嗎？
A：推薦使用轉化效率為108 cfu/μg的感受態細胞。如Yeasen的DH5α（cat NO. 11802ES），TOP⑩（cat NO. 11801ES）等。
Q：線性化載體和目的片段擴增產物的使用量和比例？
A：載體使用量應大于0.01 pmol，推薦使用量0.03 pmol；克隆載體與目的片段摩爾比應在2:1-1:5范圍內，最適為1:2-1:3，超過范圍可能會影響克隆效率。
Q：一步法快速定向克隆試劑盒適用實驗有哪些？
A：本試劑盒適用于絕大多數基于常規“酶切-連接"方法的克隆實驗，并且特別適用于其它常規方法難以快速實現的基因多點突變、全基因合成等。
Q：多片段一步法快速定向克隆試劑盒可以用于單片段的克隆嗎？
A：多片段一步法克隆試劑盒可以用于單片段的克隆。但是，單片段克隆試劑盒不建議用于多片段的克隆，重組效率可能會受到影響。
Q：一步法快速定向克隆試劑盒反應溫度是50℃，是否可以在37℃進行反應？
A：一般情況下建議在50℃進行反應。50℃有利于消除DNA的二級結構，同時是Hieff Clone®重組酶的最適反應溫度。37℃反應條件也可以進行重組反應，請根據實驗需要進行優化。
訂購信息
產品名稱 | 產品貨號 | 規格 |
Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆試劑盒 | 10911ES08 | 5 T |
10911ES20 | 20 T | |
Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆試劑盒 | 10912ES08 | 5 T |
10912ES10 | 10 T |
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