蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是影響其功能、折疊和降解的關(guān)鍵因素，在活細胞內(nèi)直接測量蛋白穩(wěn)定性一直是實驗研究中的難題。傳統(tǒng)方法往往操作復(fù)雜、耗時長，且難以在活細胞中獲得定量結(jié)果。基于內(nèi)含肽(Intein)的生物傳感器為解決這一問題提供了新思路。
內(nèi)含肽生物傳感器的原理
內(nèi)含肽是一類存在于宿主蛋白中的可自剪接多肽序列，可通過自催化蛋白剪接反應(yīng)將自身切除，并將兩端外顯肽重新連接形成成熟蛋白。由于其對肽鍵的精準重排能力，內(nèi)含肽已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程。部分微生物中的內(nèi)含肽還可感應(yīng)金屬、熱、氧化應(yīng)激等環(huán)境刺激，作為調(diào)控蛋白功能的傳感元件。基于此，研究者開發(fā)了多種剪接依賴型報告系統(tǒng)，用于篩選剪接抑制劑或構(gòu)建生物傳感器。
內(nèi)含肽生物傳感器在蛋白穩(wěn)定性監(jiān)測中的應(yīng)用
2025年，美國莫瑞州立大學(xué)Christopher W. Lennon團隊開發(fā)了一種基于內(nèi)含肽的生物傳感器，用于活細胞內(nèi)蛋白穩(wěn)定性的實時監(jiān)測。該方法的核心是將目標蛋白插入內(nèi)含肽內(nèi)部，而非直接融合于報告蛋白，有效避免了目標蛋白對報告蛋白結(jié)構(gòu)和功能的干擾。通過剪接恢復(fù)氨基糖苷類抗性基因(KanR)的功能，使剪接活性與細胞存活直接相關(guān)，便于通過生長曲線評估蛋白穩(wěn)定性。
具體而言，該方法利用內(nèi)含肽在特定條件下自發(fā)剪接的特性，將目標蛋白的穩(wěn)定性與剪接效率直接掛鉤，實現(xiàn)體內(nèi)蛋白穩(wěn)定性的定量評估。當(dāng)目標蛋白穩(wěn)定時，內(nèi)含肽剪接效率高，KanR功能恢復(fù)，細胞在含抗生素的培養(yǎng)基中存活；反之，當(dāng)目標蛋白不穩(wěn)定時，內(nèi)含肽剪接效率低，KanR功能無法恢復(fù)，細胞死亡。通過監(jiān)測細胞存活率，可以間接評估目標蛋白的穩(wěn)定性。
高通量分析的實現(xiàn)
該方法具有高通量分析的潛力。通過將不同突變體或不同處理條件下的細胞分別培養(yǎng)在微孔板中，可以同時監(jiān)測多個樣本的蛋白穩(wěn)定性。此外，結(jié)合自動化液體處理系統(tǒng)和高通量測序技術(shù)，可以進一步提高分析通量。
應(yīng)用前景
基于內(nèi)含肽的生物傳感器在蛋白穩(wěn)定性監(jiān)測中具有廣泛的應(yīng)用前景：
快速評估突變對蛋白穩(wěn)定性的影響：通過將突變體插入內(nèi)含肽內(nèi)部，可以快速篩選出影響蛋白穩(wěn)定性的關(guān)鍵突變。
藥物篩選：通過監(jiān)測藥物處理后蛋白穩(wěn)定性的變化，可以評估藥物對蛋白功能的影響，為藥物研發(fā)提供重要依據(jù)。
伴侶蛋白表達優(yōu)化：通過監(jiān)測伴侶蛋白表達對目標蛋白穩(wěn)定性的影響，可以優(yōu)化伴侶蛋白的表達條件，提高重組蛋白的生產(chǎn)效率。
小分子化合物篩選：通過識別影響蛋白穩(wěn)定性或剪接反應(yīng)的小分子化合物，可以探索其作用機制，為新藥研發(fā)提供候選化合物。
結(jié)論
基于內(nèi)含肽的生物傳感器為活細胞內(nèi)蛋白穩(wěn)定性的實時監(jiān)測提供了一種新范式。該方法具有操作簡便、高通量、定量準確等優(yōu)點，在蛋白穩(wěn)定性研究、藥物篩選和重組蛋白生產(chǎn)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，基于內(nèi)含肽的生物傳感器有望在生命科學(xué)研究和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮更大的作用。
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