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上海起發實驗試劑有限公司
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上海起發實驗試劑有限公司 |  資料大小 |
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molzym S-040-0100說明書
Mastermix 16S Basic，無DNA
用于使用自定義引物進行細菌和真菌DNA的PCR擴增
僅供研究使用
目錄號編號S-040-0100 100個反應
目錄號編號S-040-0250 250個反應
目錄號編號S-040-1000 1000個反應
產品概述
試劑盒/組件
Mastermix 16S堿性 | |||
| 100 rxn | 250轉 | 1000 rxn |
2.5×預混液（3 mM Mg2 + 終濃度） | 2 × 0.5 mL | 5 × 0.5 mL | 20 × 0.5 mL |
MolTaq 16S DNA聚合酶（非熱啟動） | 0.08 ml | 0.2 ml | 4 × 0.2 mL |
無DNA的PCR級水 | 1.7 ml | 3 × 1.7 mL | 10 × 1.7 mL |
產品描述
Mastermix 16S Basic適用于擴增細菌和真菌DNA。Mastermix 16S Basic是一種2.5x濃縮液，反應混合物的終體積為25µl。產品包含PCR運行所需的所有組分。對于PCR運行，必須加入提供的MolTaq 16S、無DNA水、定制引物和/或探針和模板以獲得完整的反應混合物。
穩定性
在適當儲存條件下，自生產日期起可穩定儲存24個月。如果包裝材料在到貨時未損壞且試劑未開封，則在外包裝盒標簽上打印的失效日期前確保試劑和緩沖液的全部性能。
應用程序
PCR擴增法檢測和鑒定細菌和真菌
包裝、儲存和處理
在標準預防措施下完成預混液的純化及其配制，以避免空氣傳播和基于操作的DNA污染。預混液以無DNA螺旋蓋小瓶中的2.5x濃縮液形式提供。接收后，將試劑盒中的所有小瓶儲存在-15 ℃至-25 ℃下。使用時，將預混液和試劑盒的其他組分在冰上解凍，取出等份試樣使用后，再次冷凍儲存。在打開小瓶和處理預混液期間，注意保持無DNA的環境。僅使用經認證的無細菌DNA移液器吸頭和PCR耗材運行檢測。定制的引物、探針和稀釋水可能含有污染的細菌DNA，將給出假陽性PCR結果。注意僅使用Mastermix 16S Basic的無細菌DNA引物、探針和稀釋水。
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質量控制和質量標準
使用無DNA水代替模板DNA的陰性PCR對照用于分析純化終預混液中細菌DNA的污染。保證使用擴增大小 > 200 bp的通用16S rDNA引物進行長達40個PCR循環，陰性對照中無信號的比率≥97%（前提是避免處理錯誤導致的污染）。無DNA的預混液定義為不產生細菌DNA特異性信號。在陰性對照運行中，必須證明凝膠電泳分析中不存在條帶。使用從金黃色葡萄球菌或其他細菌中提取和純化的已知量基因組DNA運行陽性對照。或者，使用Molzym的DNA陽性對照（目錄號：否。S-200-050）。
PCR方案
注意所有操作均在無DNA的環境（UV輻照工作站）中進行。確保塑料耗材（包括PCR小瓶、移液器吸頭、螺旋蓋聚丙烯管）與擴增反應混合物結合使用時無污染細菌DNA。按照以下步驟順序工作：
- 在室溫(18-25 ℃)下解凍預混液。渦旋幾秒鐘以混勻并短暫離心小瓶。4 ℃保存備用。將MolTaq 16S放入另一個冷卻架（-15至-25）
℃）。使用后，將組分儲存在-15至-25 ℃下。
- 移取xµl提供的無DNA水（體積為25µl）至每個PCR小瓶中。保持小瓶冷卻。
- 加入10µl 2.5x預混液
- 加入0.5µl正向引物(10µM)
- 加入0.5µl反向引物(10µM)
- 加入0.8µl MolTaq 16S
- 后加入yµl模板。密封小瓶并保持冷卻，直至置于PCR儀中
- 啟動特定試驗的程序
對于例如10個反應，使用以下移液方案（加入2µl模板DNA）在無DNA螺旋蓋或聚丙烯瓶中制備1x預混液：
- 120µl無DNA水
- 100µl 2.5x預混液
- 5µl正向引物(10µM)
- 5µl反向引物(10µM)
共8µl MolTaq 16S 238µl
從該1x預混液中移取23µl至每個PCR小瓶中，并加入2µl模板DNA或2µl提供的無DNA水（陰性PCR對照）。使用每個PCR系列，運行由從細菌培養物中提取的DNA標準品（10-100 ng/反應）組成的陽性對照。
PCR熱循環條件：
使用檢測試劑的特定條件。1x預混液多可使用40個循環。
使用標準凝膠電泳技術或雜交探測分析PCR反應。
