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上海起發實驗試劑有限公司
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上海起發實驗試劑有限公司 |  資料大小 |
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biosearchtech KASP 基因分型試驗試劑盒
我們獲得專有技術的基于PCR的KASP基因分型化學方法包括三個成分：樣品DNA，KASP分析混合物和包含兩個通用FRET卡盒的KASP Master混合物。
KASP試用套件包含
- 33個預稀釋的DNA樣品
- 2X KASP預混液
- 對照KASP測定混合物
從完成的KASP反應中讀取熒光信號所需的全部是具有FRET功能的酶標儀或qPCR儀器。
KASP 基因分型試驗試劑盒用戶指南
本指南內容
1 簡介
2 試劑盒內容物
3 進行 KASP 基因分型反應的實驗程序
3.1 KASP 基因分型反應
3.2 試劑盒組裝
3.3 KASP 基因分型混合物組裝
3.4 實驗程序
3.5 熱循環條件
3.6 其他循環條件
4 訂購信息
1. 簡介
KASP™ 基因分型試驗試劑盒作為使用 KASP 化學品的介紹提供。它使用戶能夠使用現有設備在自己的實驗室中測試化學物質。
一般而言，任何能夠在表 1 中波長處讀取 FRET 的 qPCR 儀器或酶標儀均應與 KASP 兼容。
KASP 已在廣泛的 qPCR 儀器上得到驗證，包括：
• ABI 7500
• ABI 7300
• ABI 7900
• ABI ViiA7
• 羅氏 LC480
• Agilent Mx3000P/3005P
• illumina EcoRT
• BIO-RAD CFX
2. 試劑盒內容物
該試劑盒包含 KASP 基因分型檢測試劑盒，包括檢測混合物、主混合物和 DNA：
1. 1 x 96 孔微量滴定板，含 33 份 DNA 樣品（和 3 份無模板對照），預稀釋至適用于 KASP 基因分型反應的濃度范圍。
2. 1 x 500µL 管的 2x 濃度的 KASP 主混合物（足以進行 100 次反應）
10µL）。
3. 1 x 管 KASP 測定混合物（72x 濃度）。
客戶要求
1. 快速酶標儀（激發和發射詳見表 1）
熒光團的值）
2. 一個預期用于客戶基因分型過程類型的空 PCR 板
3. PCR 級水
4. 光學透明密封件。
熒光團 | 激發波長 (nm) | 發射 (nm) |
FAM | 485 | 520 |
六角 | 535 | 556 |
腎 | 575 | 610 |
表 1：KASP 化學中使用的熒光團及其各自的激發和發射波長。
3. 進行 KASP 基因分型反應的實驗程序
3.1 KASP 基因分型反應
使用以下試劑制備 KASP 反應：
• 2x KASP 預混液
• 72x KASP 分析混合物
• DNA 樣品（提供正確濃度的樣品 DNA，用于 2x 稀釋）
• 必要時加水定容至終反應體積。
3.2 試劑盒組裝
384 孔板的總反應體積需要 5µL，96 孔板的總反應體積需要 10µL。
表 2 是如何為 384 和 96 孔板形式的 KASP 構建 60 個反應的示例。這將使您能夠為 33 個樣本和 3 個無模板對照 (NTC) 制備足夠的基因分型混合物，并提供額外的備用體積。
3.3 KASP 基因分型混合物組裝
組分 | 60 次反應的濕 DNA 法 (µL) | |
板格式 | 384 孔板 | 96 孔板 |
2x KASP 預混液 | 150 | 300 |
分析混合液 | 4.2 | 8.4 |
水 | N / A | N / A |
總反應體積 | 5 | 10 |
總計 | 300 | 600 |
表 2：KASP 反應組件示例
3.4 實驗程序
1. 解凍 KASP Master mix 和 KASP Assay mix 試管。渦旋每個試管，并在冰上儲存。
2. 解凍 DNA 板。短暫渦旋并向下旋轉微孔板。
3. 使用單通道或多通道移液器將 DNA 轉移至空反應板（客戶提供）。
- 對于 96 孔板：將提供的 5µL DNA 轉移至各孔中。
- 對于 384 孔板：將提供的 2.5µL DNA 轉移至各孔中。
4. 按照表 2 所述制備基因分型混合物 (2x KASP Master mix plus Assay mix)。向反應板中的每個 DNA 樣品中加入所需量的基因分型混合物。該程序可使用單通道或多通道移液器。
- 對于 96 孔板：向各 DNA 樣本中加入 5µL 制備的基因分型混合物。
- 對于 384 孔板：向各 DNA 樣本中加入 2.5µL 制備的基因分型混合物。
5. 用光學透明密封件密封平板。
6. 將微孔板離心至少 550 次x g. 不要以比轉子推薦的速度更快的速度旋轉微孔板。
3.5 熱循環條件
KASP 化學品可以與任何標準熱循環儀一起使用。熱循環條件詳見表 3，請注意，使用了兩步降落 PCR 方法，延伸和退火步驟合并為一個步驟。建議在分配 DNA 和基因分型混合物后盡快循環反應板。如果不可行，制備好的平板可在 4 ℃ 下儲存長達 1 小時OC. 平板分裝后應立即用光學透明密封件密封，以防止任何蒸發。
步驟 | 性狀 | 溫度 | 時間 | 每個步驟的循環次數 |
1 | 活化 | 94OC | 15 min | 1 |
2 | 變性 | 94OC | 20 s |
10 個周期 |
退火/伸長率 | 61-55OC | 60 s （下降 0.6OC/循環） | ||
3 | 變性 | 94OC | 20 s |
26 個周期 |
退火/伸長率 | 55OC | 60 s |
表 3：KASP 化學品的熱循環條件
熱循環后，讀取微孔板。
請注意：所有平板的讀數均應低于 40OC. 如果微孔板讀數未低于 40OC，不可能分析基因分型數據。
3.6 其他循環條件
如果您尚未獲得明確的基因分型簇，則應將平板熱循環額外 3 個循環，并再次讀取。回收條件請參見表 4。
步驟 | 溫度 | 時間 | 每個步驟的循環次數 |
變性 | 94OC | 20 s |
3 個周期 |
退火/伸長率 | 57OC | 60 s |
表 4：KASP 化學品進一步熱循環的條件
在獲得緊密的基因分型簇之前，可以進行進一步的循環和讀取。
圖 1 圖 2
X 軸上報告的 FAM 等位基因
圖 1：說明三個清晰簇的基因分型圖示例。FAM 等位基因在 X 軸上報告（藍色數據點），HEX 等位基因在 Y 軸上報告（紅色數據點）。綠色數據
點代表雜合子樣本，黑色數據點為無模板對照 (NTC)。
圖 2：指示 KASP 基因分型試驗試劑盒 DNA 樣本預期基因分型結果的 96 孔板布局圖。
注：本方案適用于所有三個試驗套件部件編號。三種試劑盒之間的僅有差異是 KASP 主混合物中被動參比染料 ROX 的濃度，其根據使用的酶標儀類型而變化
4. 訂購信息
產品代碼 | 性狀 |
KBS-1014-104 | 標準 Rox 試驗套件 |
KBS-1014-105 | High Rox 試模套件 |
KBS-1014-106 | 低 Rox 試驗套件 |
